Sintesi convergente di oligonucleotidi fosforodiammidati morfolino (PMO) da parte dell'H

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 12576 (2023) Citare questo articolo

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Gli oligonucleotidi morfolino fosforodiamidato (PMO) sono un tipo promettente di oligonucleotidi antisenso, ma la loro sintesi impegnativa li rende di difficile accesso. Questa ricerca presenta un approccio sintetico efficiente per i PMO utilizzando l'approccio H-fosfonato. L'uso di reagenti di condensazione di tipo fosfonio ha ridotto significativamente i tempi di accoppiamento rispetto all'attuale approccio sintetico. Inoltre, i reagenti di condensazione di tipo fosfonio hanno facilitato la condensazione dei frammenti del PMO, sintetizzando fino a 8-meri contenenti tutte e quattro le basi azotate con notevole efficacia di accoppiamento. Questo è il primo rapporto sulla sintesi convergente dei PMO. Questo approccio faciliterebbe la sintesi su larga scala dei PMO e accelererebbe la loro popolarità e accessibilità come terapia di prossima generazione.

L'approccio antisenso ha attirato l'attenzione dei ricercatori come potenziale terapia futura per controllare l'espressione dei geni correlati alla malattia1,2,3. I morfolino oligonucleotidi (PMO) fosforodiammidati, con legami internucleotidici non ionici e una struttura morfolinica, sono considerati farmaci antisenso promettenti4,5. L'elevata affinità di legame con l'mRNA bersaglio4, la specificità della sequenza6,7, la solubilità in acqua6 e la bassa tossicità del PMO7,8,9,10 sono state confermate in studi precedenti. Ad oggi sono stati approvati quattro farmaci antisenso per la distrofia muscolare di Duchenne (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) e si prevede che altri farmaci PMO verranno approvati in futuro. Inoltre, è stato sintetizzato un nuovo analogo del PMO chiamato tiofosforamide morfolino oligonucleotidi (TMO) che ha mostrato potenziale come nuovo farmaco candidato nella terapia antisenso15. I rapidi progressi nei PMO hanno aumentato la necessità di sviluppare approcci efficienti per la sintesi di PMO e analoghi dei PMO. In particolare, l’approccio sintetico, che può sintetizzare PMO su larga scala contemporaneamente, è necessario per la disponibilità della terapia antisenso per i pazienti. Fino ad oggi sono stati sviluppati molti approcci sintetici. Il primo approccio sintetico per i PMO è stato riportato da Summerton e Weller5 (Fig. 1-A). In questo approccio, i nucleosidi morfolino recanti una porzione N,N-dimetilamminoclorofosforammidato sul gruppo 5'-idrossi e un gruppo tritile (Tr) sul gruppo amminico sono stati impiegati come unità monomeriche (A). I PMO sono stati sintetizzati ripetendo la condensazione del gruppo 5'-N,N-dimetilamminoclorofosforammidato del monomero (A) con il gruppo amminico all'estremità 3' dell'oligomero dopo la rimozione del gruppo Tr all'estremità 3'5. Questo approccio è ampiamente utilizzato ma presenta diversi problemi riconosciuti, tra cui la bassa reattività dei monomeri e lunghi tempi di reazione per completare la reazione di condensazione. Nel 2012, Harakawa et al. scoprì che l'aggiunta di LiBr a una miscela di reazione era efficace e determinava una notevole accelerazione della reazione (miglioramento di circa dieci volte)16. Inoltre, Li et al.17 hanno scoperto che aumentando la temperatura di reazione a 90 °C, la reazione di condensazione veniva completata entro 8 minuti, consentendo loro di sintetizzare un 18mer-PMO in sole 3,5 ore utilizzando un reattore a flusso. Kundu et al.18 hanno riportato la sintesi del PMO utilizzando un oligo sintetizzatore automatizzato. In questo rapporto, è stata ottenuta una sintesi in fase di soluzione di PMO 3-mer utilizzando la chimica Fmoc. Inoltre, i PMO da 30 meri sono stati sintetizzati da un sintetizzatore di DNA.

Approcci attuali per la sintesi di derivati ​​del PMO.

Recentemente, Langner et al.15 hanno riportato un nuovo approccio sintetico per la sintesi di TMO utilizzando derivati ​​della fosforodiamidite come monomeri, (Fig. 1-B). A differenza del PMO, i TMO hanno un legame fosforotioamidato, che ha mostrato proprietà promettenti come oligonucleotidi antisenso. I TMO hanno mostrato un'elevata affinità di legame con l'RNA e un'elevata stabilità della nucleasi. Inoltre, i TMO chimerici hanno mostrato il loro potenziale come inibitori dei microRNA. Come mostrato nella Figura 1-B, questo approccio utilizza derivati ​​​​della morfolino fosforodiammidite recanti un gruppo 4,4'-dimetossitritile (DMTr) sul gruppo 5'-idrossi (B) come unità monomeriche. Il processo di sintesi prevedeva la condensazione di un monomero morfolino fosforodiammidite (B) con il gruppo ossidrile all'estremità 5' dell'oligomero in presenza di un attivatore acido, come 5-etiltio-1H-tetrazolo (ETT), seguita dalla solforazione del un intermedio fosforamiditico (C). La successiva detritilazione seguita da cicli di sintesi ripetitivi ha prodotto TMO. La resa di accoppiamento riportata è stata del 95–97%, con un tempo di reazione di condensazione di 5 minuti15. Sebbene questo approccio sia efficace per la sintesi dei TMO, non è applicabile alla sintesi dei PMO. Questo metodo ha fornito il derivato fosforodiammidico (C) come intermedio, ma da questo intermedio non si ottiene il legame fosforodiammidico desiderato del PMO.